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            技術(shù)文章

            Technical articles
            還在為實(shí)驗(yàn)操作而發(fā)愁嗎?2A(PP2A)試劑盒使用手冊(cè)來(lái)啦!
            更新時(shí)間:2022-06-10 點(diǎn)擊次數(shù):1078

            【預(yù)期用途】


            人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)試劑盒僅供科研使用,本試劑盒用于測(cè)定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性。


            【檢測(cè)原理】

            本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)水平。用純化的人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入蛋白磷酸化酶2A(PP2A),再與HRP標(biāo)記的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性濃度。


            【產(chǎn)品性能】


            1、物理性能


            試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,無(wú)破損漏氣(如有漏氣,不影響使用)。


            2、劑量反應(yīng)曲線線性


            標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。


            3、檢測(cè)范圍


            1.2U/L -45U/L。


            4、靈敏度


            檢出劑量不能小于0.3U/L 。


            5、精密度


            精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV 表示。CV(%) = SD/mean×100


            批內(nèi)差:取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè),每份樣本連續(xù)測(cè)定20 次,分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。


            批間差:選取3 個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定,每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定10 次,分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。


            批內(nèi)差: CV<5.9%


            批間差: CV<8.1%


            6、回收率


            分別往5個(gè)不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白,做回收實(shí)驗(yàn),得出回收率范圍和平均回收率。


            Sample TypeRange (%)Average Recovery (%)


            Tissue Lysates (n=5)93-10298


            Serum (n=5)91-10499


            EDTA plasma (n=5)95-109105


            Cell culture media (n=5)87-110101


            7、線性


            分別往5個(gè)樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白,做回收實(shí)驗(yàn),得出回收率范圍及平均回收率。將5個(gè)樣本分別稀釋2倍,4倍,8倍,16倍做回收實(shí)驗(yàn),得出回收率范圍及平均回收率。


            Sample1:21:41:81:16


            Tissue Lysates (n=5)92-105%84-95%90-102%81-93%


            Serum (n=5)81-103%81-99%86-98%83-101%


            EDTA plasma (n=5)85-97%82-101%85-96%79-91%


            Cell culture media (n=5)83-105%89-112%81-106%82-110%


            8、特異性


            本試劑盒識(shí)別天然和重組 人蛋白磷酸化酶2A(PP2A),經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應(yīng)。由于受到技術(shù)及樣本來(lái)源的限制,不可能完成所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè),因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。


            9、穩(wěn)定性


            經(jīng)測(cè)定,試劑盒在有效期內(nèi)務(wù)必按推薦溫度保存,活性降低率小于5%。為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響,實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致,尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。





            【操作步驟】


            1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑?biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。



            圖片1.png




            2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。


            3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  


            4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。


            5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。


            6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。


            7.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。


            8.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。


            9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10-20分鐘。


            10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。


            11.測(cè)定:以空白孔調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。







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