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            人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)操作流程來啦
            更新時間:2022-03-28 點擊次數(shù):1181

            【預(yù)期用途】

            僅供科研使用,本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性。


            【檢測原理】

            本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)水平。用純化的人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入蛋白磷酸化酶2A(PP2A),再與HRP標(biāo)記的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性濃度。 


            【產(chǎn)品性能】

            1、物理性能

            試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,無破損漏氣(如有漏氣,不影響使用)。

            2、劑量反應(yīng)曲線線性

            標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,大于等于0.9900。

            3、檢測范圍

            1.2U/L -45U/L。

            4、靈敏度

            檢出劑量不能小于0.3U/L 。

            5、精密度

            精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

            批內(nèi)差:取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續(xù)測定20 次,分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

            批間差:選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定,每個樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定10 次,分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

            批內(nèi)差: CV<5.9%

            批間差: CV<8.1%

            6、回收率

            分別往5個不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白,做回收實驗,得出回收率范圍和平均回收率。

            Sample TypeRange (%)Average Recovery (%)

            Tissue Lysates (n=5)93-10298

            Serum (n=5)91-10499

            EDTA plasma (n=5)95-109105

            Cell culture media (n=5)87-110101

            7、線性

            分別往5個樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白,做回收實驗,得出回收率范圍及平均回收率。將5個樣本分別稀釋2倍,4倍,8倍,16倍做回收實驗,得出回收率范圍及平均回收率。

            Sample1:21:41:81:16

            Tissue Lysates (n=5)92-105%84-95%90-102%81-93%

            Serum (n=5)81-103%81-99%86-98%83-101%

            EDTA plasma (n=5)85-97%82-101%85-96%79-91%

            Cell culture media (n=5)83-105%89-112%81-106%82-110%

            8、特異性

            本試劑盒識別天然和重組 人蛋白磷酸化酶2A(PP2A),經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。由于受到技術(shù)及樣本來源的限制,不可能完成所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測,因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

            9、穩(wěn)定性

            經(jīng)測定,試劑盒在有效期內(nèi)務(wù)必按推薦溫度保存,活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響,實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致,尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。


            【操作步驟】

            1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

            圖片1.png


            2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

            3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

            4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

            5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

            6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。 

            7.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

            8.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

            9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10-20分鐘。

            10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

            11.測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。




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