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            上海恒遠為您分享:細胞的凍存與復蘇
            更新時間:2021-02-26 點擊次數(shù):876

                  適度地保存一定量的細胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,起到了細胞保種的作用。除此之外,還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。今天的技術(shù)文章中就為大家講解一下細胞的凍存與復蘇操作方法!

             
            操作步驟
             
            (一)細胞凍存
                 1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;
                 2. 取對數(shù)生長期的細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中;
                 3. 離心1000rpm,5min;
                 4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細胞的終密度為5×106/ml~1×107/ml;
                 5. 將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;
                 6. 在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
                 7. 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。
             
            (二) 細胞復蘇
                  1.將冷凍管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,細胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率,復蘇過程中一般細胞死亡率在20%~25%之間。
                  2.迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒,然后放置在冰浴上。
                  3.小心開啟瓶蓋,把細胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱,26℃~28℃培養(yǎng)1h,讓細胞貼壁。
                  4.細胞貼壁后,小心移棄培養(yǎng)基,主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細胞及其碎片,加5mL新鮮培養(yǎng)基,26℃~28℃培養(yǎng)。
                  5.細胞培養(yǎng)24h后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層,便可以傳代。
                  6.詳細記錄復蘇細胞的名稱、數(shù)量、復蘇時間、存放部位等。
             
            注意事項
             
                 1.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存,為 對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液;
                 2.將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷;
                 3.凍存和復蘇用新配制的培養(yǎng)液。

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