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            進(jìn)口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法
            更新時間:2020-11-03 點擊次數(shù):824

            進(jìn)口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法,多采用硫酸銨分級沉淀,胰酶在 75% 飽和度硫酸銨中沉淀,其它雜蛋白一般在 10% 硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取,后在 PH8.0peng 酸緩沖液中得到結(jié)晶。

            本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗,掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學(xué)實驗準(zhǔn)備實驗樣品。

            1、胰蛋白酶原的提取與分離:稱取 1-1.5 Kg 新鮮豬胰臟,在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織,在低溫下用絞肉機絞碎胰臟 (或用高速組織勻漿機搗碎) 加 1-2 倍體積以預(yù)冷卻的 PH2.5 - 3.0 乙酸酸化水溶液提取 (按 1 g 組織相當(dāng)于 1 ml 體積計算,以此類推)。檢查提取液中 PH,若高于 PH3.0 時應(yīng)及時用 10% 乙酸調(diào)節(jié),使提取液維持 PH2.5-3.0 之間。在冷室 5℃ 左右攪拌提取 18-24 h,而后用 4 層紗布過濾,盡量擰擠出濾液,濾液呈乳白色,用約 300 mlpH2.5 乙酸酸化水再提取殘渣一次 (時間約為 1-2 h),合并濾液,此時濾液 PH 值較高,可用 5M H2PO4 溶液調(diào)整 PH 至 2.5-3.0,放置 3-5 h 后,渾濁濾液冷卻后,用玻璃漏斗進(jìn)行自然過濾,濾液呈黃色透明液體,收集濾液,量其總體積,棄去沉淀物。

            2、鹽析:濾液加固體粉狀硫酸銨進(jìn)行鹽析,使溶液至 75% 飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜,次日用 4000r/min 離心機離心,或用布氏漏斗抽濾,濾餅經(jīng)壓干后稱重,可得約 20 g 胰蛋白酶原粗制品。

            3、胰蛋白酶原得激活:將胰蛋白酶原粗制品用 10 倍體積得冷蒸餾水,分多次加入使濾餅溶解,溶液呈乳白色,量其體積,取出 1 ml 溶液用于測定,溶液中硫酸銨得含量 (約為濾餅重得 1 / 4)。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結(jié)合,硫酸鈣,如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程,按濃度量計算,將已研細(xì)的固體 CaCL2 慢慢加入酶原溶液中,邊加邊攪拌均勻。用 5MNaOH 溶液調(diào) PH 至 8.0。在酶溶液加入約 5 mg 結(jié)晶豬胰蛋白酶,輕輕攪拌均勻,置 5℃ 冰箱中使酶原活化。

            4、純化:去除雜蛋白,量取胰蛋白酶溶液體積后,用 5M 硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液 PH 至 2.5-3.0,抽濾除去硫酸鈣沉淀,濾液體積約 1000 ml,加入已經(jīng)研細(xì)的硫酸銨粉末,使其溶液達(dá) 40% 飽和度 (每升濾液加 242 g 硫酸銨)。放置 5℃ 冰箱中 5-8 h, 抽濾除去沉淀。

             希望以上文章能幫助大家了解目前研究進(jìn)展及我們的核心技術(shù),歡迎各位老師聯(lián)系我們咨詢、提出意見,愿我們的努力成果與您的科研碰撞出不一樣的火花!

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